Transcreener® HTS 是一种通用的,高通量的生化测定平台,该测定法是基于核苷酸(ADP)的检测,核苷酸可由数千种激酶催化形成,其中很多激酶的催化共价调节反应对细胞的信号传导至关重要,并作为靶标在药物发现中具有重要价值。

                                                    Transcreener®TR-FRET 测定法是一步竞争性免疫测定法,可直接检测带有远红荧光标记的核苷酸的荧光信号。该测定法是基于时间分辨荧光的共振能量转移(TR-FRET)的原理。该测定体系中使用的是与高特异性单克隆抗体 - 淬灭剂偶合物结合的远红示踪剂,在紫外范围 ( 约 330 nm ) 激发铽(Tb)配合物会导致其能量转移到示踪剂,并在更高的波长(665 nm)产生发射光。目标酶产生的二磷酸或单磷酸核苷酸置换了与抗体链接的示踪剂,导致 TR-FRET 降低 ( 图 1)。使用红色示踪剂可最大程度地减少荧光化合物和光散射的干扰。Transcreener TR-FRET 测定法是专为 HTS 设计的,采用一步添加,混合和读取的测定模式。


                                                    优势

                                                     一步添加,混合即读取的测定形式,非常适用于高通量筛选


                                                     使用远红示踪剂和时间分辨荧光技术,将荧光化合物的干扰降至最小


                                                     使用 10 μM ATP 在 10% 的转化率下达到出色的数据质量 Z′>0.7


                                                    验证要求

                                                    实现 Transcreener HTS 分析优势的一个关键因素是获取数据的酶标仪的正确设置,是否正确选择仪器设置(包括滤光片和其他组件)可能会影响仪器对任何给定测定的灵敏度。通过运行 10 μM ATP/ADP 标准曲线(24 次重复)来确定 Transcreener HTS 检测性能的关键仪器参数,并使用该标准曲线模拟酶促反应。从 10μM 浓度的 ATP 开始, ADP 的量慢慢增加,ATP 的量则按比例的减少,使腺嘌呤核苷酸总浓度保持在 10 μM。调整闪光次数来实现 Z′ > 0.5 的质量要求。如果 ATP 在 10% 的转化率下能达到 Z′ 值> 0.7,则表明该仪器能够用于 Transcreener TR-FRET 检测。

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                                                    图 1 Transcreener TR-FRET 测定原理。 该竞争性测定法使用了供体标记的抗体和作为受体的远红示踪剂。当不存在分析物时,会发生 FRET。在分析物存在下,示踪剂与抗体竞争,FRET 被破坏。


                                                    材料

                                                    ● Transcreener ADP2 TR-FRET Red Assay (cat. #3011-1K)


                                                     ATP/ADP 组合液 : 10 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 0.01%  Brij-35 and ATP/ADP (结合成恒定的腺嘌呤浓度 10 μM)


                                                     ADP 检测混合液 : 1X Stop and Detect Buffer C, 8 nM ADP2 Antibody-Tb Conjugate, 26.8 nM ADP HiLyte 647 Tracer


                                                     High FRET 混合液 : 8 nM ADP2 Antibody-Tb Conjugate, 26.8 nM ADP HiLyte 647 Tracer, 1X Stop and Detect Buffer C, 10 μM ATP


                                                    ● Low FRET 混合液 : 8 nM ADP2 Antibody-Tb Conjugate, 26.8 nM ADP HiLyte 647 Tracer, 1X Stop and Detect Buffer C, 10 μM ADP



                                                    标准曲线制备

                                                     在 384 孔板的整行中分配 10 μL 的每种 ATP/ADP 组合浓度的组合液。


                                                    ● 在这些行中加入 10 μL ADP 检测混合液。


                                                     将 10 μL 的 10 μM ATP/0 μM ADP 组合液分配到 P 行。


                                                     将 10 μL 的 High FRET 混合液分配到 P1-P12 孔中。


                                                     将 10 μL 的 Low FRET 混合液分配到孔 P13-P24 中。



                                                    微孔板读板机

                                                    SpectraMax®iD5 多功能酶标仪(Molecular Devices cat, #ID5-STD),配备以下组件:

                                                     TRF 增强? (Molecular Devices cat.#0200-7030)


                                                    ● 滤光片 320/100 (可由 Molecular Devices 提供 )


                                                     滤光片 616/10 (Molecular Devices cat. #6590-0118)


                                                     滤光片 665/10 (Molecular Devices cat. #6590-012)


                                                    SpectraMax®i3x 多功能酶标仪(Molecular Devices cat, #I3x),配备以下组件:

                                                     HTRF 检测卡盒 (Molecular Devices cat. #0200-7011)


                                                    仪器设置

                                                    SpectraMax iD5 和 SpectraMax i3x 读板机结合 SoftMax®Pro 数据采集和分析软件,使用优化的设置继续执行以下步骤:


                                                     打开 SoftMax Pro 软件,“ 读数模式“ 选择 TR-FRET,”读数类型“ 选择 Endpoint;在 SpectraMax i3x 读板机上,光学配置选择 HTRF ( 卡盒 )。


                                                     在 SpectraMax iD5 读板机上,安装 320/100 激发滤光片以及 616/10 和 665/10 发射滤光片,然后从激发和发射下拉波长菜单中选择这些滤光片。在 SpectraMax i3x 读板机上,安装 HTRF 卡盒,当选择 HTRF 作为光学配置时,波长将自动选择。


                                                     根据要检测的微孔板选择微孔板的“ 类型 ”,待测的微孔板区域选择“ 读数区域 ”。


                                                     PMT 和选项设置:将每次读取闪烁(或每次读取脉冲)设置为 20 到 100 (本文应用程序中设置为 50),测量延迟设置为 0.05 ms,积分时间设置为 0.7 ms。


                                                     针对每批新的微孔板或所使用的测定体积,最好优化微孔板位置和读板的高度。


                                                    只要体积,微孔板批次,示踪剂和浓度保持不变,相同的仪器设置可用于后续板的读取。表 1 总结了上述设置。

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                                                    表 1 SpectraMax iD5 和 i3x 读板机的推荐设置。使用新批次的微孔板或测定体积的时候,可以对微孔板位置和读板高度进行优化( 使用 SoftMax Pro Software 仪器设置中的“Show Pre-Read Optimization Options”选项 )2.png

                                                    表 2 不同读板机设置下的分析性能。

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                                                    图 2 A)在模拟 10μM ATP 向 ADP 转化的标准曲线中观测到的 Z′ 值。B)标准曲线在 0-2 μM ADP 区间的放大图,显示了 Z′ 检验的最小合格数据点( 红色虚线 )和 10% ATP 转化的检测点( 黑色虚线 )。蓝色图显示了来自 SpectraMax iD5 读板机的数据,绿色图显示了来自 SpectraMax i3x 读板机的数据,两者的积分时间均为 50 ms。


                                                    结论

                                                    在本文中,我们验证了使用 SpectraMax i3x 和 iD5 多功能读板机进行 Transcreener ADP2TR-FRET 测定过程中表现出的优越性能,通过使用优化设置,可以达到 Z′ 值 > 0.8 ( 表 2 )。对于这两种仪器,在 2% 或更高的 ATP 转化率下都达到了高于验证标准 0.7的 Z′ 值 ( 图 2 ),超过了在 10% ATP 转化下 Z′ 大于 0.7 的最低验证要求。



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